Punti chiave
- ✓HPLC = purezza (quanto vale il picco principale). MS = identità (la massa è quella giusta).
- ✓Un valore di purezza elevato per la molecola sbagliata resta il materiale sbagliato.
- ✓Nessuno dei due metodi misura acqua, sali o controioni.
Che cosa misura l'HPLC
La cromatografia liquida ad alte prestazioni separa i componenti di un campione mentre attraversano una colonna. Un rivelatore, di solito ad assorbanza UV intorno a 214 nm, dove assorbono i legami peptidici, registra ogni componente come un picco. La purezza è l'area del picco principale in percentuale dell'area totale dei picchi.
Che cosa l'HPLC non può dire
Le percentuali di purezza dicono quindi meno di quanto sembri. I dettagli del metodo (colonna, gradiente e lunghezza d'onda) influenzano il risultato.
- Se il picco principale è il peptide desiderato.
- Quanta acqua, sale o controione c'è nella polvere.
- Impurezze che coeluiscono con il picco principale o non assorbono alla lunghezza d'onda di rilevazione.
Che cosa misura la spettrometria di massa
La spettrometria di massa misura il rapporto massa/carica degli ioni. Per un peptide, la massa molecolare osservata deve corrispondere a quella calcolata dalla sequenza. Masse coincidenti sostengono l'identità; una discrepanza è un segnale serio.
Perché servono entrambe
L'HPLC senza MS può certificare un picco pulito di una sostanza sconosciuta. La MS senza HPLC può confermare la massa di qualcosa che è solo una piccola frazione del campione. Insieme mostrano un campione puro della molecola corretta.
Verificare i numeri da soli
Calcolate la massa teorica dalla sequenza con il calcolatore di massa dei peptidi e confrontatela con il CoA. Massa monoisotopica e massa media differiscono, quindi controllate quale riporta il laboratorio.
Test indipendenti e test interni
I risultati interni sono utili, ma un test di terzi elimina il conflitto di interessi. Quando un fornitore si avvale di un laboratorio esterno, nome del laboratorio, data e numero del rapporto devono comparire sul documento.
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La purezza è misurata con RP-HPLC, il metodo standard per peptidi di queste dimensioni.
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