Pontos principais
- ✓HPLC = pureza (quanto é o pico principal). EM = identidade (se a massa é a certa).
- ✓Um valor de pureza alto para a molécula errada continua sendo o material errado.
- ✓Nenhum dos dois métodos mede água, sais ou contra-íons.
O que a HPLC mede
A cromatografia líquida de alta eficiência separa os componentes de uma amostra enquanto atravessam uma coluna. Um detector, geralmente de absorbância UV perto de 214 nm, onde as ligações peptídicas absorvem, registra cada componente como um pico. A pureza é a área do pico principal como porcentagem da área total dos picos.
O que a HPLC não consegue dizer
Os percentuais de pureza dizem, portanto, menos do que parecem. Detalhes do método (coluna, gradiente e comprimento de onda) afetam o resultado.
- Se o pico principal é o peptídeo pretendido.
- Quanta água, sal ou contra-íon há no pó.
- Impurezas que coeluem com o pico principal ou não absorvem no comprimento de onda de detecção.
O que a espectrometria de massas mede
A espectrometria de massas mede a razão massa/carga dos íons. Em um peptídeo, a massa molecular observada deve corresponder à massa calculada a partir da sequência. Massas coincidentes sustentam a identidade; uma divergência é um alerta sério.
Por que as duas são necessárias
HPLC sem EM pode certificar um pico limpo de uma substância desconhecida. EM sem HPLC pode confirmar a massa de algo que é apenas uma pequena fração da amostra. Juntas, mostram uma amostra pura da molécula correta.
Conferir os números você mesmo
Calcule a massa teórica a partir da sequência com a calculadora de massa de peptídeos e compare com o CoA. As massas monoisotópica e média diferem, então verifique qual o laboratório informa.
Testes independentes versus internos
Resultados internos são úteis, mas o teste por terceiros elimina o conflito de interesses. Quando um fornecedor usa um laboratório externo, o nome do laboratório, a data e o número do laudo devem constar no documento.
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A pureza é medida por RP-HPLC, o método de referência para peptídeos desse tamanho.
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