Points clés
- ✓HPLC = pureté (quelle part représente le pic principal). SM = identité (la masse est-elle la bonne).
- ✓Un chiffre de pureté élevé pour la mauvaise molécule reste le mauvais matériau.
- ✓Aucune des deux méthodes ne mesure l'eau, les sels ou les contre-ions.
Ce que mesure la HPLC
La chromatographie liquide haute performance sépare les composants d'un échantillon lors de leur passage dans une colonne. Un détecteur, généralement l'absorbance UV vers 214 nm où les liaisons peptidiques absorbent, enregistre chaque composant sous forme de pic. La pureté est l'aire du pic principal en pourcentage de l'aire totale des pics.
Ce que la HPLC ne peut pas dire
Les pourcentages de pureté en disent donc moins qu'il n'y paraît. Les détails de la méthode (colonne, gradient et longueur d'onde) influent sur le résultat.
- Si le pic principal est bien le peptide voulu.
- Quelle quantité d'eau, de sel ou de contre-ion se trouve dans la poudre.
- Les impuretés qui co-éluent avec le pic principal ou n'absorbent pas à la longueur d'onde de détection.
Ce que mesure la spectrométrie de masse
La spectrométrie de masse mesure le rapport masse sur charge des ions. Pour un peptide, la masse moléculaire observée doit correspondre à la masse calculée à partir de la séquence. Des masses concordantes étayent l'identité ; un écart est un signal sérieux.
Pourquoi les deux sont nécessaires
Une HPLC sans SM peut certifier un pic propre d'une substance inconnue. Une SM sans HPLC peut confirmer la masse de quelque chose qui ne représente qu'une petite fraction de l'échantillon. Ensemble, elles montrent un échantillon pur de la bonne molécule.
Vérifier les chiffres soi-même
Calculez la masse théorique à partir de la séquence avec le calculateur de masse peptidique, puis comparez-la au CoA. Les masses monoisotopique et moyenne diffèrent : vérifiez laquelle le laboratoire indique.
Tests indépendants et tests internes
Les résultats internes sont utiles, mais un test par un tiers supprime le conflit d'intérêts. Lorsqu'un fournisseur fait appel à un laboratoire extérieur, le nom du laboratoire, la date et le numéro de rapport doivent figurer sur le document.
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La pureté est mesurée par RP-HPLC, la méthode de référence pour les peptides de cette taille.
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